ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ
ΣΤΟΧΟΙ
• Η εξοικείωση με τη διαδικασία απομόνωσης του DNA από κύτταρα φυτικού οργανισμού.
• Η αναγνώριση της χρησιμότητας των ενζύμων.
• Η διαπίστωση ότι ορισμένα πειράματα μπορούν να πραγματοποιηθούν πολλές φορές με απλά
υλικά καθημερινής χρήσης.
Εγγλεζάκη Φρίντα (Χημικός)
![dna2[1]](data/images/img1.gif)
ΥΛΙΚΑ
•Aκτινίδιο ή μπανάνα
•Απιονισμένο νερό (100mL)
•Aλάτι (κοινό μαγειρικό) (1g)
•Yγρό πιάτων (10ml)
•Αιθανόλη παγωμένη (95%) (5mL)
•Πεψίνη (1g/100mL H2O απιονισμένο) ή υγρό φακών επαφής
Πάγος**
ΟΡΓΑΝΑ
•Ζυγαριά
•Blender κουζίνας
•Ποτήρι ζέσεως (1Χ250mL)
•Ποτήρι ζέσεως (1Χ500mL)**
•Ογκομετρική φιάλη (250mL)
•Ογκομετρικοί κύλινδροι (1Χ100mL και 1Χ10mL)
•Στατώ με δοκιμαστικό σωλήνα (μεγάλος ~30mL)
•Ύαλος ωρολογίου
•Ράβδος ανάδευσης
•Χωνί διήθησης
•Διηθητικό χαρτί
•Σπάτουλα
•Μαχαίρι
•Παρασχίδα ξύλου
•Πεχαμετρικό χαρτί
Τρίποδας, πλέγμα, λύχνος, αναπτήρας, θερμόμετρο 0-100 0C**
Σημείωση
•Το διάλυμα της πεψίνης συνιστάται να παρασκευάζεται λίγο πριν την έναρξη τηςπειραματικής διαδικασίας ή διαφορετικά παρασκευάζεται και φυλάσσεται στο ψυγείο(θερμοκρασία 4 οC) για καλύτερα αποτελέσματα.
•Η αιθανόλη τοποθετείται στον καταψύκτη του ψυγείου 24 ώρες πριν.
**Τα όργανα αυτά χρειάζονται σε περίπτωση που θα επιλέξετε να χρησιμοποιήσετευδατόλουτρο και πάγο (δείτε την πειραματική διαδικασία).
Πειραματική διαδικασία
•Σε ογκομετρικό κύλινδρο προσθέτουμε 100mL απιονισμένο νερό και τα ρίχνουμε σε έναποτήρι ζέσεως.
•Ζυγίζουμε 3g αλάτι σε ύαλο ωρολογίου και τα προσθέτουμε στο ποτήρι ζέσεως,αναδεύοντας με τη ράβδο ανάδευσης μέχρι να διαλυθεί πλήρως το αλάτι.
•Κόβουμε το ακτινίδιο σε μικρά κομμάτια και τα προσθέτουμε στο αλατόνερο.
•Ρίχνουμε το μίγμα στο blender και ομογενοποιούμε για 5 δευτερόλεπτα.
•Προσθέτουμε 5mL απιονισμένο νερό στον ογκομετρικό κύλινδρο των 10mL και στη συνέχειασυμπληρώνουμε με 5mL υγρό πιάτων.
•Μεταφέρουμε το ομογενοποιημένο μίγμα στο ποτήρι ζέσεως και προσθέτουμε το διάλυματου υγρού πιάτων, αναδεύοντας ήπια με τη ράβδο και προσέχοντας να μην δημιουργηθούνφυσαλίδες.
•Στη συνέχεια φιλτράρουμε το ομογενοποιημένο μίγμα περνώντας το από το χωνί (ήσουρωτήρι) με το φίλτρο και συλλέγουμε το υγρό σε ποτήρι ζέσεως.
•Τοποθετούμε το τελικό μίγμα σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 60 0C για 15 λεπτά και στησυνέχεια σε πάγο για 10 λεπτά (Το στάδιο αυτό μπορεί να παραληφθεί χωρίς να επηρεασθείη απομόνωση του DNA)
•Μεταφέρουμε περίπου 10mL από το διάλυμα στο δοκιμαστικό σωλήνα και προσθέτουμε 5-7σταγόνες διαλύματος πεψίνης ανακινώντας το σωλήνα ήπια.
•Κρατώντας το σωλήνα με μικρή κλίση, προσθέτουμε περίπου 5mL παγωμένη αιθανόλη, έτσιώστε να σχηματιστεί ένα στρώμα αιθανόλης πάνω από το διάλυμα.
•Τοποθετούμε το σωλήνα στο στατώ και αφήνουμε το διάλυμα σε ηρεμία για 2-3 λεπτά.
•Χρησιμοποιώντας τη γυάλινη ράβδο ήτην παρασχίδα ξύλου της οποίας τοάκρο το έχουμε μετατρέψει σε θύσανο,συλλέγουμε τα νουκλεϊκά οξέα πουβρίσκονται σε μορφή νήματος στηφάση της αιθανόλης
•Τα νουκλεϊκά οξέα αρχικάσυγκεντρώνονται στην επιφάνειαεπαφής μεταξύ διαλύματος καιαιθανόλης και σταδιακά αναδύονταιστη φάση της αιθανόλης.
Θεωρητικές Επισημάνσεις
Υπάρχουν διάφορα πρωτόκολλα απομόνωσης του DNA από οργανισμούς φυτικών ιστών(αρακάς, κρεμμύδι, μπανάνα, ακτινίδιο, φράουλα κλπ). Έχοντας γνώση της δομής τωνφυτικών κυττάρων καθώς και του μορίου του DNA μας βοηθάει να κατανοήσουμε καλύτερα τιςτεχνικές με τις οποίες μπορούμε να το απομονώσουμε.
Ομογενοποίηση (ομογενοποιώντας το μίγμα με το blender επιτυγχάνεται το σπάσιμο των κυτταρικώνκαι πυρηνικών μεμβρανών καθώς και του κυτταρικού τοιχώματος με μηχανικό τρόπο).
Προσοχή χρειάζεται ώστε κατά τη διαδικασία να διατηρείται μέτρια ταχύτητα για πολύ μικρό χρονικόδιάστημα (5’-7’ δευτερόλεπτα είναι αρκετά), γιατί ενδέχεται να σπάσει και το DNA.
Διήθηση (βοηθάει ώστε να κατακρατούνται τα θραύσματα των μεμβρανών και των οργανιδίων).
Απορρυπαντικό ( διασπά τα λιπίδια των κυτταρικών και των πυρηνικών μεμβρανών των κυττάρων,στις οποίες επικρατούν οι υδρόφοβοι δεσμοί των φωσφολιπιδίων).
Θέρμανση (Διευκολύνεται το σπάσιμο των κυττάρων και αδρανοποιούνται οι νουκλεάσες τωνκυττάρων οι οποίες διαφορετικά μπορεί να κόψουν τα ινίδια των νουκλεϊκών οξέων σε μικρότερακομμάτια).
Πεψίνη (Είναι ένα ένζυμο η οποία απομακρύνει τις πρωτεΐνες (ιστόνες) οι οποίες είναι συνδεδεμένεςμε τα μόρια των νουκλεϊκών οξέων).
Αλάτι (βοηθάει στην καταβύθιση των νουκλεϊκών οξέων καθώς τα ιόντα Na+ σπάζουν τουςηλεκτροστατικούς δεσμούς μεταξύ των πρωτεϊνών και του DNA).
Αλκοόλη (η παγωμένη αλκοόλη έχει μικρότερη πυκνότητα από το νερό με αποτέλεσμα ναδημιουργούνται 2 φάσεις. Το DNA είναι αδιάλυτο στην αιθανόλη η οποία μαζί με το αλάτι διευκολύνειτην καταβύθισή του με αποτέλεσμα αυτό να αναδύεται σταδιακά στη φάση της αιθανόλης).
Βιβλιογραφία
•Biological Science, A Molecular Approach, BSCS Blue Version, Toby Klang.
•Εργαστηριακός Οδηγός, Βιολογία Γ’ Θετικής Κατεύθυνσης, Β. Αλεπόρου-Μαρίνου, Α.Αργυροκαστρίτης, Α. Κομητοπούλου, Π. Πιαλόγλου, ΟΕΒΔ.
•Απομόνωση Νουκλεϊκών Οξέων, ΕΚΦΕ Χαλανδρίου & Ν. Ιωνίας.
•Απομόνωση Νουκλεϊκών Οξέων, ΕΚΦΕ Αργολίδος.
•Φωτογραφίες ( Μ. Μπαρμπαρή, Φ. Εγγλεζάκη).
•Iternet, http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/howto/ (How to extract DNAfrom everything living).
![dna8[1]](data/images/img10.gif)